大力水手讨厌霜霉病 | GBS-BSA定位抗性基因座
Development of molecular markers linked to three spinach downy mildew resistance loci
菠菜霜霉病的主要病原是霜霉属真菌，是菠菜种植过程中的多发病害，主要危害叶片，从而影响产量和商品质量。病初叶面产生淡绿色小点发展成淡黄色病斑，以后扩大成不规则病斑，叶背病斑着生白色霉层。
虽然有多种防治方法，如杀菌剂的方式可以控制病情，但对于有机种植而言，培育抗霜霉病的植株对于种植生产而言是最根本，最迫切的防治方法。霜霉病抵抗是比较典型的质量性状，已有至少6个抗性基因座被发现，但由于新的霜霉菌菌种的出现，经常会打乱抗菌植株的培育计划。因此，对抗霜霉病基因的扩大研究在菠菜育种计划中就显得格外的重要。本文主要研究对象是3个抗霜霉病基因座：RPF1，RPF2和RPF3，分别可以抵抗17种已知病原中的12种，11种和9种，同时存在3种抗性基因理论上可以抵抗16/17种霜霉菌株。通过霜霉病敏感株Viroflay与分别含有3种抗性基因的抗病株进行回交，构建BC3（NIL）分离群体。3个NIL群体分别使用霜霉菌株6号，10号和12号对其抗性进行评估。GBS-BSA方法结合进行抗性基因定位，获得候选标签，并进行引物设计，最红获得引物对RPF1(13对)，RPF2(2对)和RPF3(7对)。该基因座已知有2个标签与RPF1标签是共连锁的：Dm1和5B14r。通过对Dm1和5B14r分别构建人工染色体（BAC）文库，共获得总共克隆体59个。对克隆体DNA进行测序获得抗性基因RPF1的测序序列，并进行特异性扩增引物的设计。通过对NIL1群体和抗性亲本Califlay的组装分析，鉴定抗性基因SNPs标签，进行特异性引物的设计。根据RPF2特异性序列和引物匹配信息，在BSA分析结果中发现了1个在分离群体中存在差异的引物：primer UA529。在分离群体中对每个混池个体基因组DNA进行扩增，验证差异。将目标序列插入质粒中并进行扩增培养，并进行测序和特异性引物设计。最终，本文作者获得有效标签引物共22对，其中RPF1基因座引物13对，RPF2基因座引物2对，RPF3基因座引物7对，其中大部分通过SNP标签或Indel设计。RPF2-1即为primer UA529是通过SCAR构建分析的方式获得的。在此基础上，作者对引物进行了大规模测试实验，确定其扩增特异性和抗性鉴定的稳定性。在针对RPF1基因开发的13对引物中，RPF1-8表现优异，在192个样本的盲测中，对RPF1的抗性表型全部预测正确。RPF2-1在131个盲测样本中有125个样本预测正确，而预测失败的6个样本的抗性来源不是RPF2基因。RPF3-3和RPF3-5在全部抗性个体中均有扩增条带，而在所有敏感个体中都没有，说明这两个标签与RPF3的共连锁。并且RPF3-5在192个盲测样本中全部预测正确。RPF1-3和RPF2-2引物只对这两个抗性基因进行了扩增，表明了高度特异性。RPF3-3对RPF2和RPF3基因可以进行特异性扩增。RPF3-5虽然对所有样本均可进行扩增，由于这对引物是根据Indel原理设计的，可从扩增条带结果中看出针对RPF3基因座进行特异性扩增的条带大小，是小于RPF1或RPF2基因的。在经过大规模引物的内测和盲测之后，所获得的的抗性基因引物已经可以在实际育种过程中投入使用，快速筛选含抗性基因的亲本用于杂交培育。那这些引物针对的这些抗性基因标签，与已知的抗性基因标签之间是什么关系呢。
已知的RPF1，RPF2和RPF3标签都存在共连锁的标签。
在本文结果中，有3个标签重复出现，RPF3-1，RPF3-6和RPF3-2。根据3个重复出现的标签与已知的3个抗性基因标签的遗传距离，可以确定彼此连锁关系。获得了多个经有效验证的抗性基因标签，扩充了菠菜抗霜霉病基因的区域。
这些能够快速区分纯合和杂合抗病植株的标签（引物），能够明显的缩短菠菜杂交种植系统中筛选自交系抗病亲本的时间。通过本文研究的遗传图谱可以推测，RPF3标签位于RPF1和RPF2之间，这与该领域早先的研究描述并不一致，这个问题还有待后续研究探明，可以考虑加大群体样本数以获得更可靠的遗传距离信息。将RPF抗性基因座的范围扩大，并提供了更多的候选育种位点，也证明更多的分子手段可以应用在育种工作中，有利于延长抗病持久性。本文亮点特异性扩增引物的设计和测试，意味着这些抗性基因的特异性引物可以直接应用于育种计划的亲本筛选中，涵盖研究-发现-验证-应用，可谓是真正的一条龙服务呀。